產(chǎn)品介紹

基 因 型MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101,  trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1簡 要 說 明Y187菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母單雜，雙雜實驗用菌株，MATα型，可直接轉化質粒或與MATa型酵母菌株（Y2HGold，AH109等）通過mating操作進行篩庫試驗。Transformation  marker為: trp1, leu2，報告基因為：lacZ, MEL1。Y187 -GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。質粒PGBKT7的篩選標志為TRP1，用于表達DNA-BD(來自酵母轉錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白；質粒PGADT7的篩選標志為LEU，用于表達AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理：一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域：位于N端1 ~ 174位氨基酸區(qū)段的DNA結合域（DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸區(qū)段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下，BD不與AD結合，將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合，形成bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey發(fā)生相互作用，就會促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報告基因的轉錄。Y187有兩個報告基因：lacZ, MEL1，分別由兩種不同的啟動子（G1，M1）啟動，這兩種啟動子只有GAL4識別的17bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。High5TM系列Y187感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，經(jīng)PGADT7質粒檢測轉化效率>104cfu/μg DNA 。 操 作 說 明1.取1管感受態(tài)細胞置冰上融化，6 000 rpm離心1min，去掉上清。2.加入320 μl LiTE/PEG溶液，重懸細胞，然后加入10μl Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復一次)，預冷目的質粒2-5ug,體積不多于20ul。3.充分混勻，于30度250 rpm轉速下培養(yǎng)30 min。4.42度熱激2.5min。5.6000 rpm離心1min，去掉上清。6.加入1 ml TE溶液，溫和重懸細胞。7.6000 rpm離心1min，去掉上清。8.加入100 μl TE溶液，重懸細胞，將細胞涂布于相應的營養(yǎng)缺陷型固體合成培養(yǎng)基。9.30度倒置培養(yǎng)48-96h，直至形成大小合適的酵母菌落。Preparation of Media：YPDA （1L）:Tryptone                20gyeast extract            10g 0.2% adenine           15ml補水到 950ml，  用鹽酸調PH到6.5Agar              20g (for plates only)121度，15分鐘高壓滅菌，待培養(yǎng)基溫度降到55度時，加入已過濾的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine    2g補水到1L，溶解后高壓滅菌 或0.22um 濾膜過濾除菌 注 意 事 項1.感受態(tài)細胞最好在冰上融化。2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。3.同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。4.Y2HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數(shù)下降。5.菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現(xiàn)象。當細胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole（AIR）在細胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。

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