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基 因 型MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ簡 要 說 明AH109菌株來源于PJ69-2A 酵母菌株，將lacZ報告基因引入PJ69-2A誕生了AH109，此菌株是Clontech公司開發的GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株，MATa型，可直接轉化質粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation  marker為: trp1, leu2，報告基因為：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1。AH109 -GAL4酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。質粒PGBKT7的篩選標志為TRP1，用于表達DNA-BD(來自酵母轉錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白；質粒PGADT7的篩選標志為LEU，用于表達AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4系統原理：一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域：位于N端1 ~ 174位氨基酸區段的DNA結合域（DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸區段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下，BD不與AD結合，將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey發生相互作用，就會促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報告基因的轉錄。AH109有四個報告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分別由三種不同的啟動子（GAL1，GAL2，MEL1）啟動，這三種啟動子只有GAL4識別的17bp核心區相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發生的概率。High5TM系列AH109感受態細胞經特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，經PGADT7質粒檢測轉化效率>104cfu/μg DNA 。操 作 說 明1.取1管感受態細胞置冰上融化，6 000 rpm離心1min，去掉上清。2.加入320 μl LiTE/PEG溶液，重懸細胞，然后加入10μl Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復一次)，預冷目的質粒2-5ug,體積不多于20ul。3.充分混勻，于30度250 rpm轉速下培養30 min。4.42度熱激2.5min。5.6000 rpm離心1min，去掉上清。6.加入1 ml TE溶液，溫和重懸細胞。7.6000 rpm離心1min，去掉上清。8.加入100 μl TE溶液，重懸細胞，將細胞涂布于相應的營養缺陷型固體合成培養基。9.30度倒置培養48-96h，直至形成大小合適的酵母菌落。Preparation of Media：YPDA （1L）:Tryptone                20gyeast extract             10g 0.2% adenine            15ml補水到 950ml，  用鹽酸調PH到6.5Agar                20g (for plates only)121度，15分鐘高壓滅菌， 待培養基溫度降到55度時，加 入已過濾的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine    2g補水到1L，溶解后高壓滅菌或0.22um 濾膜過濾除菌注 意 事 項1.感受態細胞最好在冰上融化。2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。3.同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。4.Y2HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。5.菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole（AIR）在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。6.酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養可見直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養可見直徑1mm克隆。

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