產品介紹

基 因 型MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL1簡 要 說 明Y1HGold菌株是Clontech公司開發的GAL4-AbA酵母單雜系統用菌株，MATα型，可直接轉化質粒進行篩庫試驗。Transformation marker為: ura3，leu2；報告基因為：AbAr。Y1HGold -GAL4-AbA酵母單雜系統需要兩種質粒配套使用：pAbAi和PGADT7。質粒pAbAi的篩選標志為URA，用于表達 pBait-AbAi construct (1~3個bait DNA序列重復串聯后克隆到pAbAi中)；質粒PGADT7的篩選標志為LEU，用于表達AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4-AbA酵母單雜系統原理：Aureobasidin A (AbA)是一種環酯肽抗生素，在低濃度(0.1-0.2ug/ml) 下即可對酵母產生毒性。基因組中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株（Bait-Reporter Yeast Strains），當獵物蛋白（Prey）結合到誘餌序列（Bait DNA）上，GAL4 AD就會激活AbAr 的表達，從而能夠在含有抗生素AbA的培養基上生長。AbAr與營養缺陷報告基因相比具有更低背景的優點，可以降低酵母單雜假陽性發生的概率。High5TM系列Y1HGold感受態細胞經特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，經pAbAi質粒檢測轉化效率>103cfu/μg DNA 。操 作 說 明1.取pBait-AbAi質粒5ug，BstBI 或 BbsI酶切1小時，回收。2.取100 μl冰上融化的Y1HGold感受態細胞，依次加入預冷的線性pBait-AbAi質粒1-5ug（體積不高于15ul），Carrier DNA（95-100度5min,快速冰浴，重復一次）10 ul ，PEG/LiAc  500ul并吸打幾次混勻，30度水浴30 分鐘（15 min時翻轉6-8次混勻）。3.將管放42度水浴15min（7.5 min時翻轉6-8次混勻）。 4.5000 rpm離心40s棄上清，ddH2O 400ul重懸，離心30s棄上清。5.ddH2O 50ul重懸，涂SD/-Ura平板,29℃培養72h。6.挑取5-10個克隆，用PCR方法確定pBait-AbAi整合到Y1HGold基因組中，PCR陽性菌株在SD/-Ura平板劃線，29℃培養72h，4℃保存，此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。Preparation of Media：YPDA （1L）:Tryptone                20gyeast extract             10g 0.2% adenine           15ml補水到 950ml，  用鹽酸調PH到6.5Agar                 20g (for plates only)121度，15分鐘高壓滅菌，待培養基溫度降到55度時，加入已過濾的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine    2g補水到1L，溶解后高壓滅菌 或0.22um 濾膜過濾除菌注 意 事 項1. 感受態細胞最好在冰上融化。2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。3.同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。4.Y1HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。5.菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole（AIR）在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。6.酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養可見直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養可見直徑1mm克隆。

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