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基 因 型Agrobacterium rhizogenes(kanR  ) Ar A4 Ri(agropine  type)簡 要 說 明發根農桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細菌，它能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物以及個別裸子植物。Ar.A4發根農桿菌菌株含有農桿堿型Ri質粒，具有廣泛的宿主范圍（玉米，煙草，胡蘿卜，甘草等），同時具有卡那霉素抗性。生物開發的Ar.A4發根農桿菌電轉感受態特別適用于大質粒的轉化：經pK7WGF2質粒 (size:11876 bp)檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA；經pK7WGF2-ZH質粒（size:40 kd）檢測轉化效率可達5×103 cfu/μg DNA。操 作 說 明1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。2. 取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質粒DNA（體積不大于6ul，最好用試劑盒抽提，雙蒸水溶解；轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態-質?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。3. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯從冰中拿出，吸水紙吸干外表面水份，快速放入電轉槽中，啟動電擊，電擊完成快速插入冰中，加入1 ml無抗生素的TY，并轉移到感受態空管中，28℃振蕩培養2~3小時。4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天注 意 事 項1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。2. 電轉感受態細胞中不可混入氣泡，轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量或最終用于涂板的菌量。4.  Ar.A4具有卡那霉素抗性，不可用于具有卡那霉素抗性質粒的轉化。

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