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基 因 型C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR) Nopaline簡 要 說 明EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質粒含有篩選標簽：strep、kan，賦予EHA101菌株鏈霉素抗性和卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作，經pK7WGF2質粒檢測轉化效率可達104 cfu/μg DNA。操 作 說 明1.取-80℃保存的農桿菌感受態于冰上待其部分融化，處于冰水混合狀態時插入冰中。2.每100 μl 感受態加1 μg（體積不大于10 μl）質粒DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。3.加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃，200rpm振蕩培養2~3小時。4.6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天。注 意 事 項1.加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。2.混入質粒時應輕柔操作，轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。3.利福平濃度不應高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板同時含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。4.培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質粒丟失的概率極低 (可以忽略)。

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