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基 因 型C58 (rif R) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) (strepR) Succinamopine簡 要 說 明EHA105菌株由EHA105菌株改造而來，為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) ，此質粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移）。pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)型Ti質粒含有篩選標簽：strep，賦予EHA105菌株鏈霉素抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉基因操作，經pCAMBIA2301質粒檢測轉化效率可達104cfu/μg。操 作 說 明1.取-80℃保存的農桿菌感受態于冰上待其部分融化，處于冰水混合狀態時插入冰中。2.每100μl感受態加1ug（體積不大于10ul）質粒DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、28℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃振蕩培養2~3小時。4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50ug/ml kan 時，28℃培養48h即可；平板中同時加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時，需28℃培養60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養72-90h）。注 意 事 項1.加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10 ；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。2.混入質粒時應輕柔操作。3.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量4.利福平濃度不應高于25ug/ul，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉化效率降低到1/2。5.5、培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質粒丟失的概率極低（可以忽略）。

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