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基 因 型C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline(pSoup-tetR)簡 要 說 明 GV3101(pSoup)菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性；在GV3101菌株中轉入help質粒：pSoup即為GV3101(pSoup)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質粒在農桿菌中復制，同時賦予該菌株四環素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。生物開發的GV3101(pSoup)電轉感受態特別適用于大質粒的轉化：經pGs2(卡那霉素抗性)質粒檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA；經pGs2-ZH(卡那霉素抗性)質粒(size:40 kd)檢測轉化效率可達5×103 cfu/μg DNA。操 作 說 明1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。2. 取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘，待其融化，加入1-5 μg質粒DNA（質粒體積不大于6ul，最好用試劑盒抽提，雙蒸水溶解），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態-質?；旌衔锟焖僖频诫姄舯校w上杯蓋，空管保留待用。3. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態空管中，28℃振蕩培養2~3小時。4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90 h）。注 意 事 項1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。2. 轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質粒丟失的概率極低 。

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