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基 因 型F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR)簡 要 說 明 Rosetta 2(DE3)菌株來源于BL21，是BL21的衍生菌株，為Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內的降解。將具有氯霉素抗性的pRARE2質粒導入BL21 (DE3)細胞中即是Rosetta 2(DE3)，pRARE2質粒可補充大腸桿菌缺乏的7種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG)對應的tRNA，提高外源基因的表達水平。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區 (DE3區含有T7噬菌體RNA聚合酶)，可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質粒的蛋白表達。Rosetta 2(DE3)感受態細胞由特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率達108 cfu/μg DNA。 操 作 說 明1. Rosetta 2(DE3)感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質粒并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的LB無菌培養液，37℃，200 rpm復蘇60分鐘。4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取50 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的LB培養基上。5. 將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。注 意 事 項1. 感受態細胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。2. 轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。3. 誘導時，IPTG濃度可選（0.1-10 mM均可）。4. 為獲得需要量的蛋白，最佳誘導時間，溫度，IPTG濃度需實驗者優化。5. Rosetta 2(DE3) 菌株攜帶 pRARE2質粒，除復蘇培養基為無抗生素外，其余所用培養基、培養液均應含有34 µg/ml氯霉素，以防質粒丟失。

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