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基因型:F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galE15 galK λ- rpsL nupG簡 要 說 明High5TM系列DH10B感受態細胞只能用于電擊轉化而不能用于熱激轉化。DH10B菌株來源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10B菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA ，無論真核生物還是原核生物的基因組DNA都能被高效的轉入DH10B中。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。φ80dlacZ?M15標記的存在使DH10B可用于藍白斑篩選，rpsL賦予其鏈霉素抗性。High5TM系列DH10B感受態細胞適用于大質粒的構建或者各種文庫構建。High5TM系列DH10B感受態細胞經特殊工藝制作，經 pUC19質粒檢測，轉化效率>1010cfu/μg。 操 作 說 明1. 0.1cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。2. 取-80℃保存的High5TM 系列DH10B感受態細胞放入冰浴中融化，加入1 μl目的DNA (質粒或連接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻立即插入冰中。A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒pUC19；B. 對于連接產物，請用乙醇沉淀DNA后適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。3. 用200 μl槍頭將感受態-質粒混合物快速移到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。4. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.4 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數，使用者也可按所用電轉儀推薦的參數操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。5. 立即 向電擊杯中加入1ml不含抗生素的無菌培養基 S.O.C.，混勻后轉移到空50ml管中，并用1ml SOC輕柔沖洗電轉杯并轉移到50ml管中，另補加3ml SOC培養基， 37℃，200 rpm復蘇60分鐘。6. 5000rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養基上。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。如果進行藍白斑篩選操作，將平板放37℃培養至少13h。注 意 事 項1.加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10。2.當質粒不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉化效率急劇下降。3.若轉化大質粒或想獲得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。4.對于連接產物轉化，最好轉化前用乙醇沉淀DNA后適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率，增加打火的風險。5.混入質粒時應輕柔操作。6.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

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